Determinazione della Km della fosfatasi alcalina 

per il 4-nitrofenil fosfato 

 

 

PROCEDIMENTO:

 

La velocitą di reazione viene misurata con metodo spettrofotometrico in continuo, a diverse concentrazioni di 4-nitrofenilfosfato (4-NPP), in presenza di una concentrazione costante di enzima (0,01 U per test).

 

reagente

 ml I

ml II

ml III

ml IV

ml V

Tris-HCl 2M, pH 8

1,500

1,500

1,500

1,500

1,500

4-NPP 0,3 mM

0,100

0,135

0,200

0,400

0,800

H2O

1,400

1,365

1,300

1,100

0,700

Volume finale

3,000

3,000

3,000

3,000

3,000

 

Si mettono in grafico i valori dei reciproci delle velocitą misurate in funzione dei reciproci delle corrispondenti concentrazioni di substrato.

La retta teorica ha la seguente equazione:

Quindi, elaborando i punti attraverso il metodo dei minimi quadrati troviamo rispettivamente l'intercetta sull'asse delle ascisse e delle ordinate:

KM = -1/(intercetta sull'asse delle x)

VMAX = 1/(intercetta sull'asse delle y)

 

CONDIZIONI OPERATIVE:

 

Per il principio fare esperimento all'esperimento precedente riguardante l'attivitą fosfatasica.