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Determinazione dell'attività della fosfatasi alcalina. Esperienza di cinetica enzimatica.
PROCEDIMENTO:
Per la misura dell'attività fosfatasica si misura spettrofotometricamente alla lunghezza d'onda di 400 nm la quantità di 4-nitrofenilfosfato, in due miscele che differiscono tra loro per il volume del campione aggiunto. Le miscele sono così composte:
Prima dell'aggiunta del campione, le cuvette vengono lasciate equilibrare per qualche minuto a 25 °C nel porta cuvette del bagno termostatato. Subito dopo l'aggiunta del campione viene registrata per diversi minuti l'estinzione del 4-nitrofenolato, si può ricavare l'incremento di concentrazione di prodotto nel tempo e quindi le unità internazionali di enzima (U) espresse in µmoli/min: U = µmoli/min = [(DE/min)/1e] * Volume test (ml) e è il coefficiente di assorbimento molare del 4-nitrofenolato a 400 nm ed a pH alcalino, pari a 17 mM-1*cm-1, 1 è lo spessore della cuvetta espresso in cm. Le unità vengono solitamente riferite ad un volume unitario di campione. La formula complessiva per il calcolo in questo caso è la seguente:
CONDIZIONI OPERATIVE:
Le fosfatasi catalizzano l'idrolisi degli esteri dell'acido fosforico. Distinguiamo una fosfatasi acida da una alcalina a seconda del pH a cui si esplica la loro massima attività. Oltre a questi due tipi di fosfatasi, relativamente aspecifiche, esistono altre fosfatasi specifiche per determinati esteri fosforici (ad esempio la glucosio-6-fosfatasi, la fruttosiodifosfatasi ecc..). La fosfatasi alcalina (fosfoidrolasi di un monoestere fosforico, EC 3.1.3.1) è presente in tutti i tessuti umani e animali ed è pure diffusa tra i microrganismi. E' particolarmente abbondante nella bile e negli osteoblasti. Nel siero di sangue e negli estratti di organi si evidenziano parecchi isoenzimi. La determinazione della fosfatasi alcalina nel siero è largamente impiegata nella pratica del laboratorio clinico come elemento diagnostico in parecchie malattie. Un aumento dei valori nel siero dovuto a cause patologiche è rilevabile nell'uomo tutte le volte che è coinvolta l'attività degli osteoblasti (metastasi ossee, osteomalacia, rachitismo) o ci si trova davanti ad affezioni epatiche e in particolare delle vie biliari da parte di calcoli o tumori. Un aumento fisiologico si riscontra invece durante il periodo dello sviluppo corporeo, prima dei 18 anni. La fosfatasi alcalina è presente anche nel latte e viene inattivata dal calore. Il dosaggio dell'enzima nel latte rappresenta quindi un indice dell'avvenuta pastorizzazione (test di pastorizzazione). Il migliore substrato per il dosaggio della fosfatasi alcalina è, sperimentalmente dimostrato, il 4-nitrofenilfosfato. Tale composto non è certamente un substrato fisiologico dell'enzima, tuttavia viene rapidamente idrolizzato in vitro dalla fosfatasi, dando un prodotto di idrolisi, il 4-nitrofenolo, che in ambiente alcalino sviluppa una colorazione nettamente gialla:
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